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2022-04-08 14:42:33| 人氣23| 回應0 | 上一篇 | 下一篇
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鑒定蔀茇醯胺作為一種新的 E3 連接酶配體以誘導蛋白質降解2

時間依賴實驗顯示0.1 μM的955在8小時內可以完全降解CDK9, wash out后其降解效果可持續長達18小時,在293T細胞和K562細胞中也觀察到了類似的結果。TurboID測定是一種強大的鄰近標記方法,它可以通過生物素化蛋白質來敏感地檢測微弱和暫態的蛋白質相互作用。 他們採用TurboID技術,通過在293T細胞中異位表達V5-TurboID-CDK9並比較使用或不使用955處理的生物素化蛋白質,識別和表徵955募集的特定E3連接酶介導CDK9降解(Figure 5A)。 該測定的結果表明,955可以誘導CDK9與6種不同的E3連接酶的相互作用(Figure 5B)。 結合ABPP法鑒定的PL結合的E3連接酶與TurboID法鑒定的955結合的E3連接酶,他們發現KEAP1是在兩種方法中均結合的E3連接酶。

為了確定KEAP1是否是955募集的用於降解CDK9的E3連接酶,他們首先使用免疫印跡來確認TurboID試驗的結果。 他們發現,在生物素存在的情況下,955處理后的KEAP1比沒有955處理的情況明顯更多。 隨後,他們將CDK9與HiBit-tag和KEAP1與Halo-tag融合以進行

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nanoBRET測定,以進一步測試955是否可以誘導活細胞中CDK9:955:KEAP1三元複合物的形成(Figure 5G)。 該測定的結果表明,955可以與CDK9和KEAP1以劑量依賴性方式形成三元複合物,而陰性對照分子336僅誘導非常弱的三元複合物形成,表明該三元複合物的形成取決於955與KEAP1的共價結合。 因此,他們認為955可以共價招募KEAP1介導CDK9的降解。

5的抗腫瘤功效,他們首先比較了在MOLT4 細胞中955和 SNS-032誘導的整體蛋白質組變化,細胞在用0.1 μM 955 處理后1小時內CDK9 顯著減少,而用1 μM SNS-032處理6小時對CDK9 沒有影響。 有趣的是,955也可以以蛋白酶體和CRL依賴性方式有效降解CDK10,這是一個令人驚訝的發現,因為SNS-032對CDK10的結合親和力非常低。 隨後,他們對用於蛋白質組分析的相同樣本進一步進行了RNA-seq分析來研究其轉錄變化。 結果證實,955 在處理6小時后下調MOLT4 細胞中CDK9依賴性轉錄的作用比SNS-032更有效,955在下調mRNA和蛋白質水準的c-Myc和MCl-1表達方面比SNS-032強約10倍。

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隨後,他們進一步比較了955與SNS-032在前列腺癌細胞系中的抗增殖作用,他們選擇兩個AR陽性(LNCaP和22RV1)和兩個AR陰性(PC3和DU145)細胞系進行了研究,發現955對所有四種細胞系都表現出抗腫瘤活性,EC50值在3-9 nM 範圍內, 而SNS-032對這些細胞系的EC50值超過100 nM,這些結果表明955比SNS-032對腫瘤細胞更有效。為了進一步評估PL作為新型共價E3連接酶配體用於設計降解蛋白的 PROTAC的潛力,他們通過將PL與色瑞替尼連接以降解EML4-ALK,其中降解劑819在NCI H2228 NSCLC細胞中以濃度依賴性方式降解EML4-ALK,這表明819 也可能招募KEAP1來介導NCI-H2228細胞中EML4-ALK的降解。

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