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2008/9/1/15:44  

李耀忠，李愛華，岳思君，韓楠楠      李耀忠， 宁夏大學后勤處， ７５００２１， 宁夏銀川。     李愛華（通訊作者）、岳思君、韓楠楠， 單位及通訊地址同第一作者。     １ 材料和方法     １﹒１ 材料     １﹒１﹒１ 試驗菌种      黑曲霉 （Ａｓｐｅｒｇｕｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、白地霉（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃａｎｄｉｄｕｍ）、米曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｃｈｒａｃｅｕｓ） 為宁夏大學飼料工程中心保藏的菌种。     １﹒１﹒２ 試驗動物及日糧組成     將４０只体重１５﹒０～１６﹒０ｇ健康的ＩＣＲ小公鼠分成１０組，每組４只，即對照組和試驗１～９組，組間体重差异不顯著（Ｐ＞０﹒０５），編號、分籠飼養。試驗所用試驗小鼠和基礎日糧均由宁夏醫學院試驗動物中心提 供，試驗所用基礎日糧組成見表 １。                １﹒１﹒３ 培養基     察氏培養基﹕硝酸鈉（ＮａＮＯ３） ３ ｇ、磷酸氫二鉀 １ ｇ、硫酸鎂（ＭｇＳＯ４‧７Ｈ２Ｏ） ０﹒５ ｇ、氯化鉀 ０﹒５ ｇ、硫酸鐵 ０﹒０１ ｇ、蔗糖 ３０ ｇ、瓊脂 ２０ ｇ、水 １ ０００ ｍｌ， ｐＨ 值 ６﹒８～７。    麥芽汁培養基：大麥芽粉５０ｇ、水１５０ｍｌ、雞蛋１個，ｐＨ值６﹒８～７。     馬鈴薯培養基﹕馬鈴薯塊 ２００～３００ ｇ、葡萄糖２０ｇ、瓊脂２０ ｇ、水１０００ｍｌ，ｐＨ值５﹒５～５﹒７。     １﹒２ 方法     １﹒２﹒１ 真菌添加劑的制備     將實驗室冰箱保藏的白地霉、黑曲霉、米曲霉菌接种于相應的斜面培養基上活化后分別制成含１﹒０×１０８、３﹒１×１０８ 和２﹒３×１０８個／ｍｌ孢子懸液， 以６﹒６％、２﹒１％和２﹒８％的接种量，在２８ ℃、１２０ｒ／ｍｉｎ的搖床上液体培養７２ｈ，再以 ５％的接种量接种到由小鼠基礎日糧組成的固体培養基中，２８℃發酵 ７２ｈ，風干后制成真菌飼料添加劑，并按２５％的比例加入小鼠基礎日糧中， 制成飼料備用。     １﹒２﹒２ 試驗設計     用不同比例的黑曲霉、白地霉、米曲霉發酵物制成９种真菌飼料添加劑， 試驗方案見表２。                 １﹒２﹒３ 酶活的測定     分別用ＤＮＳ法和 Ｆｏｌｉｎ法測定真菌飼料添加劑中ＣＸ酶和酸性蛋白酶的酶活。     ＣＸ酶酶活單位定義﹕在ｐＨ值４﹒６、５０ ℃條件下，１ｍｉｎ內從羧 甲基纖維素鈉鹽溶液中降解釋放１ｍｍｏｌ還原糖所需要的酶量為一個酶活單位（Ｕ）。     酸性蛋白酶酶活單位定義﹕１ｇ固体酶粉在ｐＨ值３﹒０、４０ ℃條件下，１ｍｉｎ水解酪素產生 １μｇ酪氨酸所需要的酶量為１個酶活單位（Ｕ）。     ＣＸ酶酶活（Ｕ／ｇ）＝葡萄糖含量／５×ＥＷ﹔     酸性蛋白酶酶活（Ｕ／ｇ）＝酪氨酸含量×４×ｎ／１×１０。     式中﹕葡萄糖含量———查標准曲線得出（ｍｍｏｌ）﹔        ５———与底物作用的時間（ｍｉｎ）﹔     ＥＷ———１ ｍｌ液中所含酶量（ｇ）﹔     酪氨酸含量———查標准曲線得出（μｇ）﹔      ４———反應試劑体積（ｍｌ）﹔     ｎ———樣品稀釋倍數（ｍｌ／ｇ）﹔     １———參与反應的　液量（ｍｌ）﹔     １０———反應時間（ｍｉｎ）。     １﹒２﹒４ 飼喂与稱重      試驗開始和 ３ 周時各組小鼠空腹 １ ｄ 逐只稱重，分別作為初重和末重， 每天飼喂 ２ 次， 各組飼養管理條件一致， 同時每周空腹逐只稱重 １ 次以觀察其生長情況并記錄。     ２ 結果与分析     ２﹒１ 真菌飼料添加劑對小鼠增重的影響（見表 ３）                  從表３可見，９個試驗組對小鼠均有增重效果，３周后９個試驗組平均增重１１﹒８ ｇ／只，比對照組提高１４﹒８９％。不同菌种及配合比例的飼料添加劑對小鼠增重率的效果也各异，其中２組（白地霉﹕黑曲霉﹕米曲霉＝３﹕２﹕５）增重率（２５﹒２４％）最好，其次為７組（１００％白地霉），增重率（２４﹒２７％）較高，均達到极顯著的水平（Ｐ＜０﹒０１）﹔ 而 ６ 組和１組（白地霉、黑曲霉、米曲霉以３﹕５﹕２和５﹕２﹕３ 的比例） 增重率較差，分別為２﹒９１％和５﹒８３％。就复合菌种組成的添加劑對小鼠增重率的效果來看，米曲霉比例高的效果好，黑曲霉比例高的效果差一些。單菌种組成的添加劑對小鼠增重率的效果依次是白地霉＞米曲霉＞黑曲霉。     ２﹒２ 酶活的測定（見表 ４）                    由表４可見，不同菌种及其配合比例制成的真菌飼料添加劑 ＣＸ酶和酸性蛋白酶的酶活各异，其中 ８組（１００％黑曲霉）和２組（白地霉﹕黑曲霉﹕米曲霉＝３﹕２﹕５）的 ＣＸ酶酶活最高， 分別高達 １５７﹒７８ Ｕ／ｇ 和１２６﹒２８ Ｕ／ｇ，而９組 （１００％米曲霉）ＣＸ酶酶活較差，１３﹒０５Ｕ／ｇ。以 ８ 組的酸性蛋白酶酶活最高達９７﹒００ Ｕ／ｇ，而以 ９ 組酸性蛋白酶酶活最低。     ３ 小結与討論     試驗結果表明，３周后 ９ 個試驗組平均增重 １１﹒８ ｇ／只，比對照組提高 １４﹒８９％，其中 ２ 組增重效果最好，增重率較對照組提高 ２５﹒２４％， 差异极顯著（Ｐ＜０﹒０１）。     單菌株添加劑增重效果均顯著（Ｐ＜０﹒０１、Ｐ＜０﹒０５）﹔多菌株飼料添加劑中有２、３和４組的增重效果顯著（Ｐ＜０﹒０１、Ｐ＜０﹒０５），而 １、５和６組的增重效果不顯著，可能因為該真菌添加劑作用机理除其含粗酶制劑及菌体蛋白外還含有活菌，不同种屬真菌進入動物腸道后因其之間可能存在著相互拮抗或共生現象，表明在研制多种真菌的生態制劑或微生物添加劑時，應注意菌株間的生物拮抗關系。     各真菌飼料添加劑中 ＣＸ酶和酸性蛋白酶的酶活不同，其中８組和２組的ＣＸ酶酶活最高， ８組的酸性蛋白酶酶活最高，而 １００％的米曲霉添加劑組酸性蛋白酶活最低。真菌飼料添加劑中 ＣＸ酶和酸性蛋白酶酶活的高低對小鼠增重率的影響規律性不強，但有 ＣＸ酶酶活高、ＣＸ酶酶活和酸性蛋白酶酶活比例差异大可使小鼠增重率提高的趨勢，其增重的效果和机理還有待于進一步研究。     近年來隨著我國動物微生態學研究的崛起，微生態制劑的研究及運用正方興未艾，它不僅能保護和維持畜禽、魚類等動物腸道的微生態平衡，進而增強它們對疾病的防治能力，而且還可以促進動物生長發育、增重育肥、提高蛋白產量及飼料轉化率。     霉菌大量存在于土壤中，不是動物腸道中的正常微生物，但近年來，該類微生物在飼料工業中作為高品質的飼料添加劑被廣泛應用，以提高家禽、家畜的生產性能，尤其是反芻動物。用于反芻動物微生物飼料添加劑生產的菌种主要有黑曲霉和米曲霉。這些曲霉菌都能產生纖維素酶，有利于反芻動物對纖維素的消化和吸收利用。曲霉能透過植物表皮角質層屏障，破坏纖維素的結构完整性，降解含木質素的植物細胞壁，使其能被動物更有效的消化，特別是在粗飼料成分較多的情況下，曲霉更顯出其重要作用。黑曲霉還能產生淀粉酶、蛋白酶和果膠酶。米曲霉能產生植酸酶，使磷從植酸和植酸鹽中釋放出來，被動物充分吸收利用，提高鈣、鎂、鋅、銅的吸收。白地霉可作為飼料添加劑，具有很高的營養价值且生長繁殖快，對培養基要求不高。