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生物化學實驗

組別：5
組员：94451110游綉文 94451118廖如瑩 94451141黃婉蓉94451142李俊杰
94451139吳小媚 94451133黃寶進92451143曾廷嘉
學號: 94451143 蔡莉君
實驗名稱：蛋白質之定量分析
實驗日期：11/1
研究目的：以呈色法測定溶液中蛋白質的含量，利用已知重量的蛋白質製作標準曲線，再計算未知蛋白質的含量。
(1)實驗材料及配方：標準溶液：100 ㎍/ml 蛋白質溶液、樣品溶液：靈芝酵素、試管、蛋白質測量uv280 595波長機器、Coomassie Brilliant Blue G-250 呈色劑。
研究方法：(一)標準溶液之配製:
1.取100 ㎍/ml 蛋白質溶液 1 ml 進行連續稀釋。
2.準備試管分別先放入1 ml的純水，取一支試管加入蛋白質溶液 1 ml，在進行連續稀釋，稀釋倍數為1/2、1/4、1/8、1/16，濃度 (㎍/ml)為50、25、12.5、6.25
3.將稀釋好的標準溶液及樣品，從試管中分別取1 ml 以玻璃 cuvette 測定波長280 nm下之吸光值, 並紀錄之。
(二)蛋白質樣品之稀釋:
1. 取樣品靈芝1 ml，加入已裝好1 ml的純水試管中，進行連續稀釋，稀釋倍數為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32
( 三)呈色反應及吸光値測定:
(2)將稀釋好的標準溶液及樣品分別加入1 ml 的Coomassie Brilliant Blue G-250 呈色劑。
(3)混合均勻，室溫下靜置5分鐘。
(4)分別取1 ml 以玻璃 cuvette 測定波長595 nm下之吸光值, 並紀錄之。『分光光度計,需以純水歸零。每根測定後須以酒精 及蒸餾水沖洗玻璃 cuvette 避免殘留。』
結果討論：
1. 蛋白質其他定量方法?
UV 吸光法:(Utraviolet Absorption Method)一般有機物質，對於波長在250 nm 以下的光才有吸收作用，但含有苯環的胺基酸(aromatic amino acids)，對於波長250 nm 以上的光卻有吸收作用。凡含有此等胺基酸的蛋白質，其水溶液對於波長在260 nm至290 nm (通常取280 nm波長)之光，均有吸收作用，其吸收量與蛋白質溶液的濃度成正比。所以含有phenylalanine、tyrosine或tryptophan的蛋白質，均可採用此法來定量。不過，本法易受對於280 nm附近的光也有吸收作用的其他化學物質的干擾。核酸對於260 nm的光有很大的吸收作用，而對280 nm 的光吸收作用僅及前者1/10，在生物體中，蛋白質常與核酸結合在一起，故蛋白質之定量宜作下列修正：蛋白質溶液概約濃度(mg/ml) = 1.45 A280 – 0.74 A260。胺基酸的aromatic group在280 nm 有吸光，蛋白質peptide bond骨架上的基團在200 nm 附近有吸光。由於各種蛋白質所含aromatic amino acids組成不一，它們在280 nm 的吸光值能力亦不同。

aromatic amino acids 最大吸光波長
Phenylalanine 260 nm
Tyrosine 275 nm
Tryptophan 280 nm

2. 試繪圖說明如何用連續稀釋法進行1/10的稀釋?
取樣品1ml 加入9 ml生純水試管中，再從第一隻取1 ml加入第2隻以此類推