Human umbilical cord blood (UCB)
UCB-derived MSCs(UCB-MSC)
Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)
recombinant TRAIL (rTRAIL)
The artificial TRAIL gene [secretable trimeric TRAIL (stTRAIL)]
Adenoviral vectors delivering the stTRAIL gene (Ad-stTRAIL)
coxsackie-adenovirus receptor (CAR)
multiplicities of infection (MOI)
protein transduction domain (PTD)
用MSC攜帶TRAIL治療GLIOMA(神經膠質瘤)
用濾過性病毒傳送治療基因,藉由直接注射到腦腫瘤或治療後的腫瘤空窩,無法擴展到長出的腫瘤,因腫瘤細胞的遷移能力及它們滲透到正常腦軟組織,新的有效治療工具,需特別的標地腫瘤細胞特別是這些細胞已經從主腫瘤塊脫離.
近年來報告建議,可以幹細胞當作運送治療基因的媒介.神經幹細胞在實驗的膠質瘤發行廣範的趨性並朝向長出的微小衛星遷移，但臨床上的應用,神經幹細胞因為民族性問題受限制,
因為他的獨立性與異體移植時會發生免疫學的不相容.
此外,MSC為對付標地運送及局部腫瘤生物學作用物產生的新方法,這報告顯示MSC在臨床上非常吸引人,因為它們具有腫瘤標地性質,可以輕易的孤立或擴展到需要的使用數量,且可以與濾過性病毒帶菌者處理遺傳學上的問題.
UCB是成人幹細胞替代來源,許多報告指示UCB-MSC與骨隨幹細胞的細胞特徵方面類似及多系分化的潛力,在早先的研究,我們發現能產生多種效果的UCB-MSCS,有分化成各種不同中胚層組織的能力,(骨頭,軟骨腱,肌肉.和脂肪)內胚層組織(肝細胞)和外胚層組織(神經元)
最近, UCB-MSC被證實比骨髓取得的MSC在細胞的獲得,儲存,與移植都是較有利的.
另外,骨髓取出的MSC的數量及分化能力,隨著年齡有相當大程度的減少.UCB的細胞或新生血液.較成人細胞不成熟,且從不相關的移植捐贈者不會觸發一個巨大的免疫反應,這特性使的
UCB-MSC在異源性MSC治療為臨床上的有力候選者.
腺病毒帶菌者傳送stTRAIL基因顯示高腫瘤刪除能力,然後腺病毒帶菌者傳遞完整長TRAIL基因到體外及體內,延長stTRAIL休息時間並傳送它滲透到腫瘤細胞,因此我們預估UCB-MSC 分泌stTRAIL當作腦腫瘤治療的傳送媒介.
此外,大部份缺乏回應的腺病毒帶菌者被用做以Ad5為基礎來轉換MSC, Ad5透過一個二雙相性的過程後,其代有主要附屬物到細胞的CAR並經由整聯蛋白表現在標地細胞的相互作用!
然而,藉由一般的Ad5轉換MSC是無效的,即使是使用在非常多種的感染後,因為MSC並不表現
CAR.另外,腺病毒基因傳達的方法在治療GLIOMA上是比較吸引人的,要使細胞增加進入腺病毒帶菌者須透過PTD,可誘導如:DNA,PEPTIDE,PROTEIN,VIRUS到細胞,而我們使用的PTD(4Hp4),可以有相當程度的增加腺病毒transduction到MSC.
在體內的遷移報告中指出,在將TUMOR CELL接種至前突低七天後, MSCs-EGFP被移入相對半球,或將PKH26標幟上MSCs-stTRAIL植入腫瘤,並在接種後4.7.10天用螢光或共焦顯微鏡觀察.並評估細則存活率及末梢去氧核醣核苷轉移脢. U-87MG 或UCB-MSCs CELL接種於24WELL PLATE上,其Ad-stTRAIL或rhTRAIL數量增加,並被加入確定TRAIL腫瘤細胞毒性.
治療2-3天後,用MTS分析細胞存活率,而在培養試驗中, MSCs-stTRAIL或U87-stTRAIL植入TRANSWELL,插入包含個濃度的小洞.然後U-87MG則在底層開始生長.在抑制報告中, MSCs-stTRAIL生長於上層, U-87MG於下層,然後中和抗人類TRAIL抗體,加到下層5天後, U-87MG以MTS測其存活率,而觀察細胞凋零則是將MSCs-stTRAIL和U-87MG先混合,然後培養在FOUR-WELL CHAMBER SLIDES 48小時,再用TUNEL染色來觀察.
流式細胞儀偵測死亡的TRAIL接受器, 死亡的TRAIL表現出DR4, DR5, DcR1, and DcR2,細胞在冰上和各種抗體染色30分,然後用PBS沖洗,再用流式細胞儀分析死的接受器.
stTRAIL蛋白質分泌,浮在培養基上或是腦組織,是用ELISA來分析,為研究轉移基因的表現,在體外, UCB-MSCs或U-87MG重於高密度的WELL轉換成Ad-stTRAIL,含有病毒的MEDIUM被清除,並加入含低血清的MEDIUM.然後收集CULTURE上清液,每三天更換新鮮的MEDIUM,並評定不同時間間隔分泌的TRAIL.
而在體內,TUMOR鼠stTRAIL的表現，腫瘤組織在MSCs-stTRAIL治療後1.4.7.10.14天於RIPA BUFFER發現有細胞溶解現象.
在老鼠GLIOMA的治療
體外MSCs-stTRAIL的治療效果評估,在TUMOR接種七天後實行內腫瘤注射,對照鼠注射
MSCs-EGFP or MSCs-stTRAIL , PBS), and Ad-stTRAIL ,來做生還試驗,為評估抑制腫瘤生長,對照組注射未變性的MSC或MSCs-stTRAIL並用PBS治療.另藉組織學分析TUMOR大小低評估中,
如先前描述，腦在治療時,在TUMOR接種後在特定時間點做腦部連續的切面及H&E染色,而最大的TUMOR部份是經過確定的,而描述部份的圖點是藉由NIH Image software來計算的.
體內細胞凋零分析及免疫細胞組織學
鼠腦散佈伴隨著PBS,並隨MSCs-stTRAIL植入後,於一特定時間點麻醉,切下的腦POSTFIXED OVERNIGHT,並給予含30%蔗糖的PBS兩天,崁入固定的腦細胞,用LN2冷凍並置於-70℃至要使用時.用ANTI-TRAIL(R&D系統)染色上原始抗體或抗人類核仁,原始抗體檢測到Cy3-或螢光結合抗生蛋白鏈菌素,發現細胞凋零活動,TUNEL如上述來完成於某些部位,而核仁則被DAPI複染.
RESULT
PTD在UCB-MSC及腺病毒的傳導能力效能
人類原始MSC對WILDTYPE腺病毒是相對上有抵抗力的,因為腺病毒接受器(CAR)的低值表現,因此我們先證實是否人類UCB-MSC在傳遞CAR PROTEIN的研究中有無被使用, UCB-MSC表現的CAR用西方墨點法是偵測不到的,因此,我們管理PTD媒介腺病毒的轉導,如同獨立CAR的傳染方式,而Ad-stTRAIL基因傳導進入UCB-MSC的能力是確定的.我們發現UCB-MSC的傳導能力可以藉由結合4HP4到Ad-stTRAIL這媒介而有非常大的提高.
然而沿著增加的MOI和4HP4濃縮,細胞死亡也是增加的,儘可能反映出可導致細胞病變的腺病毒帶菌者引起細胞損傷導致過度的TRANSGENE表現4HP4和低劑量的腺病毒完全高量生產物,此蛋白質產物不影響細胞存活率並使UCB-MSC有最佳傳導能力.另外,一有意義的依賴劑量在有GFP的細胞被檢測到增加,並提高轉導能力,在視覺上的觀察是明顯的。
當Ad-EGFP傳染在4HP4出現時CARRYOUT,此外. MSCs-stTRAIL與U87-stTRAIL的TRANSGENE表現,是有限制的細胞分割下的計劃.ELISA分析法是不同時間點在轉導顯示MSCs-stTRAIL分泌保持不變至23天,然後開始衰弱,然而, U87-stTRAIL細胞在八天後發生減少.
UCB-MSCs在體外及體內朝向GLIOMA移動的能力,已經有報告指出,由GLIMA細胞釋放的要素可能是一個可趨向MSC的引誘物,在體外,利用TRANSWELL PLATE做這TEST,並用人類正常星形細胞來模仿正常腦環境來當做CONTROL,只有少數細胞從FIBROBLAST或正常星形細胞移往無血清MEDIUM及有條件之MEDIUM,而MSCs-stTRAIL和NIH3T3細胞或星形細胞在有條件的MEDIUM下做比較,則受U-87MG.U-251MG,或A172刺激而產生明顯遷移.
然而MSCs-stTRAIL的遷移能力用DOES-DEPENDENT的方式描述.我們也證實未變性的MSC在GLIOMA CELL以一溫和的模式在有條件MEDIUM下轉換成MSCs-stTRAIL,這顯示. GLIOMA CELL可以刺激MSC轉移,且UCB-MSCs遷移能力不被腺病毒轉導受影響.
接下來,我們研究在體內,移植MSC是否會朝腦GLIOMA遷移,MSC-FGFP在MSC接種到對側半球七天後，MSC從最初注射部位朝腫快移動,然而MSC-FGFP停留在正常腦的注射處,這些細胞大部份保留在胼胝體和腫瘤與正常腦組織之間,它們也滲透倒腫瘤底層,我們同樣證實MSCs-stTRAIL接種到對測半球朝腫塊方向遷移,更重要的標有PKH26的MSCs-stTRAIL直接注射到腫瘤底層,在MSC接種4-10天後,廣大的擴散到腫塊,即使MSCs-stTRAIL停留在注射處,他們大部份遷移到腫瘤邊緣與正常組織的接觸面,而這些細胞在距離腫塊遠方的衛星腫瘤的胼胝體也看的到,實驗顯示MSCs-stTRAIL的遷移發生在第4天,評估從開始注射TRAIL分泌的量,及第10天MSC停留在腫瘤邊緣正常組織分介面的量.實驗證實,仿造轉換或非轉換細胞移向顱內膠質瘤,用一柔和的方式來轉化MSC,因此,這結果顯示UCB-MSC有絕佳遷移能力及GLIOMA驅向.
TRAIL誘導U-87MG產生APOTOSIS但UCB-MSC不誘導,評估TRAIL在U-87MG和UCB-MSC上細胞毒性效能量的評定.我們將細胞培養在含有各種不同rhTRAIL濃度的MEDIA,並感染上升的MOI及Ad-stTRAIL,這是一個重要劑量在U-87MG存活率下降時補充,
rhTRAIL或感染Ad-stTRAIL對照上, UCB-MSC在rhTRAIL蛋白質或TRAIL基因TRANSFER上,甚至是在高濃度MOI,都沒有減低存活率,檢測TRAIL對UCB-MSC的抵抗力,細胞表面表現TRAIL接受器,具有DR4及DR5,以FLOW來測得.
研究中發現UCB-MSC所分泌的stTRAIL經由腺病毒得轉導,藉由具細胞穿透性PEPTIDE為媒介並以此為條件證明這些細胞可以向GLIOMA方向遷移,另外,當我們以UCB-MSC分泌的TRAIL治療實驗鼠時,相當大的變形在腫瘤的生長及存活者延長部份發生在實驗鼠腦腫瘤的相對位置.
我們以一有人類膠質母細胞瘤的老鼠來評估遷移能力與人類MSC治療學的功效,最近,已經被報導的報告中,人類異種移植物膠質母細胞瘤在免疫缺乏的實驗鼠表現病理組織學特徵與腫瘤侵入正常/非腫瘤性的腦軟組織並不互相矛盾,即使實驗鼠的腫瘤邊緣地區並沒有像人類的膠質母細胞瘤那樣擴散,因此,實驗鼠可以概括的顯示出人類膠質母細胞瘤的病理組織學特徵,再現性及可用性.
在體外UCB-MSCs的遷移受到在有條件下培養的膠質瘤細胞之一依賴劑量方式刺激,這指示膠質瘤細胞釋放溶解因素可以引導往MSC遷移,而這些已知的腫瘤分泌因子補充了骨髓的內皮細胞與內生性基質細胞朝向腫塊前進,而這樣的反應與受損或發炎後的細胞重塑相似.而這些特殊腫瘤遷移在治療學上的應用還需要更多的說明.
在體內實驗中，我們發現當注射到腦對測或腫塊時UCB-MSC顯示了一個可以穿過長出的膠質瘤細胞的能力. UCB-MSC有很多優點,像與成人細胞比較,這未成熟的細胞擁有較佳包容力,低風險的濾過性病毒感染,較少捐贈者的磨損,及較少的蘚著免疫反應,因此, UCB-MSC的跟蹤能力在治療glioma的增生癌細胞上,這是一個
重要的策略,在報告中顯示, UCB-MSC表現TRAIL,可以在不傷害正常細胞或組織的情形下產生一巨大變形的APOPTOSIS.
從各項實驗結果得知,TRAIL的腫瘤特異性細胞毒性與投與MSC基因的治療效果來看. U-87MG和UCB-MSC與不同劑量的Ad-stTRAIL或變化的rhTRAIL結合. RhTRAIL治療2天或Ad-stTRAIL治療3天後細胞存活率用MTS來分析,與MSC結合者產生較高之存活率,於TRANSWELL PLATE的實驗也顯示,MSC-stTRAIL較U87-stTRAIL具有較佳的TRAIL分泌能力.而在實驗鼠的腦腫瘤大小測驗中,經MSC-stTRAIL治療者也較PBS及MSC單獨治療後的腫塊SIZE來的小許多.用KAPLAN-MEIER方法來測其生還者, MSC-stTRAIL也具較佳的生還能力.存活時間也最久.
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