實驗材料與藥品：材料：1. 新的手套，新的口罩！（重要）
2. 自製小塑膠袋（用滅菌袋＋封口機做的）大小約 4 x 15
3. RNA 區的 pipetman
4. RNA 區的 Filter tip
藥品：1. Trizol （Invitrogen（紅色）或是 BioMan（藍色），用買的）（1 cc / sample ）
2. DEPC treated ddH
2O （買的或自己配，DEPC有劇毒，滅菌後會分解）（400 μl / sample）
3. Chloroform : EtOH = 24 : 1 （在RNA區，懸空用倒的避免污染）（200 μl / sample）
4. Isopropanol （一般買來的）（500 μl / sample）
5. Ice colded 70~75% 和 95%~100% EtOH （DEPC treated ddH
2O 配製）（1 cc / sample ）
6. 4% H
2O
2（可以殺RNase）
實驗前準備：當天1. 拿液態氮。
2. 大的冰桶。
3. 自製的小塑膠袋。
4. 拿自己的小袋子裝Trizol tip、Trizol Eppnedorf還有自製小塑膠袋。
4. RNA區有 filter 的 tip。
5. 自己滅菌新的且標記好的Eppendorf 組織數 x 5（T、W、I、S、M）。
（Ｔ）： 空的，磨完Tissue裝Trizol用
（Ｗ）：預先加入 300 μl DEPC treated ddH
2O，Trizol濾去雜質後
（Ｉ）：預先加入500 μl isopropanol，chloroform分離後
（Ｓ）：空的，儲存用
（Ｍ）：空的，測量用
6. 分裝好的DEPC treated ddH2O
7. 預冷離心機到4℃。
8. 裝好10 ml 4%雙氧水的 15 ml 離心管。
9. 在抽氣櫃鋪上一層無塵紙。
10. 分裝 Chloroform : EtOH = 24 : 1，每 20 個 sample 分裝 5 cc 到 50 cc 離心管。（用倒的避免污染）
實驗流程：收取組織（當天 or 好幾天前）
1. 取下組織後，放入Eppemdorf，以液態氮急凍，之後冰到-80℃冰箱。
Trizol研磨組織1. 於-80℃取出要使用的組織，將所有Eppendorf放到厚的塑膠袋中，再整個放到液態氮中。
2. 每次倒出一個Eppendorf的組織，到自製的小塑膠袋中。
3. 加入1cc Trizol並以rack研磨自製小塑膠袋中的組織。
4. 抽出Trizol到原本裝Sample的Eppendorf
，置於冰上。
4-1. 若是脂肪組織，置於加熱器上，37℃ 600 rpm 10 min。
（600 rpm 是那台機器的建議值，過高怕壞掉）
5. 離心 9000 rpm, 4 ℃, 10 min。（此時會有殘渣在底部，脂肪組織還會有油脂跟結締組織在表面）
5-1. 若是脂肪組織，先撥開表面的殘渣，到中間層吸取 800 μl Trizol到新Eppendorf
（Ｔ），（ tip 離開時要刮掉周圍的殘留組織）再離心一次。
（Liver與WAT的比較，磨Liver的Trizol會比較偏向深紅色）
6. 取 700μl 上層的Trizol 到到裝有 200 μl 的Eppendorf
（Ｗ），上下翻轉混合。
（剩餘的Trizol要吸到Trizol專用廢液桶，Eppendorf置於抽氣櫃內風乾）
RNA 萃取（此部份將沒有Trizol保護，要避免污染）
1. 每一管各加入 200 μl chloroform，上下翻轉混合，置於室溫 3 min。
（避免vortex，gDNA會斷，混進RNA）
2. 離心 15000 rpm, 4℃, 10 min。
3. 取 80% 的上清液（約500 μl）到預先裝有 500 μl isopropanol 的Eppendorf
（Ｉ）中，上下翻轉混合，置於室溫 10 min。（千萬別取到中間白色的Protein與下層的Trizol。）
5. 離心 15000 rpm , 4℃, 10 min，此時底部會有白色或透明的 RNA pellet，沒有也要繼續做。
（這步驟要將pellet強力固定在eppendorf底部，固定Eppendorf方向，開口朝圓心，pellet會在另一方向）
6. 輕輕倒出上清液（要一次倒出，避免液體殘留），加入1 cc Ice colded 75% 酒精 （DEPC treaed ddH
2O配製，習慣先放在 4℃ 比較冰），上下翻轉混合清洗pellet。
7. 重複步驟 5 和 6，但改用95%或100% ice colded 酒精。（此步驟可幫助脂肪組織RNA去除油脂）
8. 離心 15000 rpm , 4℃, 10 min。
（這步驟要將pellet強力固定在eppendorf底部，固定Eppendorf方向，開口朝圓心）
9. 先用1cc filter tip 吸出酒精，再用 200 μl tip 吸出殘留的酒精。
（注意：不要碰到 pellet 離心下來的固定位置）
10. 於加熱器 56℃ 乾燥 RNA 約1~5分鐘（乾燥過久會降低 pellet 的水溶性，也增加污染風險）。
11. 以 適量 DEPC treaed ddH
2O 回溶 RNA。（看不到pellet用20，一點點用30，中量用70，大量用100）
11-1. 離心 15000 rpm , 4℃, 10 min。
（此步驟視情況使用，可去除沒回溶的pellet，可能難溶，也可能是Protein，可能干擾濃度與純度）
12. 抽出 （回溶體積-5）μl RNA 到新Eppendorf
（Ｓ）儲存用，剩下 5 μl RNA 到另一個Eppendorf
（Ｍ）確認濃度與品質（回溶狀況好的話，用原本的
（Ｉ）也可以）。
13. 測完濃度後，以DEPC treated ddH
2O 調整濃度，使每一管濃度一致，然後分裝。
（For RT PCR 建議濃度用 0.125 μg / μl）
（以RNA狀態儲存於-80℃只能放約兩個月～半年，視情況轉成cDNA存放）
14. 跑膠確認 16s, 28s RNA（真核生物）的狀況。
特別注意事項：
1. DNase的使用，可以增加RNA的品質，但是Trizol法一般沒在用，通常是Kit在用。
2. 跑膠可能有4條 band，分別是最上面的gDNA、28S、18S、5S
3. 從28S、18S的比例，可以看出有沒有degrade的現象，一般來說要1：1
4. 用 4% 雙氧水噴手套，然後用擦手紙擦乾，有沒有殺RNase的效果我不確定，做心安的XD
